Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни

На правах рукописи


КЛАДОВА Анна Юрьевна


АССОЦИАЦИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ КОЖИ С ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА.


14.00.11. – кожные и венерические заболевания


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата мед наук


Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО Столичной мед академии имени И.М.Сеченова и Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва.


НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ доктор мед наук, доктор

^ Молочков Владимир Алексеевич

доктор био наук, доктор

Киселев Всеволод Иванович


ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор мед наук, доктор

Халдин Алексей Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни Анатольевич

доктор мед наук, доктор

Сергеев Юрий Валентинович

^ ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Столичный Муниципальный Медико-Стоматологический Институт (МГМСУ)

Защита диссертации состоится «____» ______________ 2007 г. в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.040.10 при Столичной мед академии имени И.М.Сеченова Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни по адресу: 119992, г. Москва, ул. М. Трубецкая, д.8


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «____» ______________ 2007 г.



Ученый секретарь диссертационного Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни совета, доктор мед наук, доктор



Эрдес Светлана Ильинична



^ Актуальность задачи.

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) – одна из часто встречающихся групп опухолей человека, отличающаяся значимым многообразием. Отмечаемый в последние годы неуклонный рост заболеваемости ЭОК некие создатели именуют Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни «бесшумной эпидемией» [Чиссов В.И. и др. 2004; Glass A. et al. 1989; Nguen T. et al. 2002; Holme S. et al. 2000]. Исследование этиологии и патогенеза ЭОК, остающихся в текущее время детально не исследованными, представляет значимый Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни энтузиазм, сначала, исходя из убеждений оптимизации исцеления и профилактики этих опухолей [Снарская Е. C. и др. 2004; Молочков В.А. и др. 2006; Kirkwood J. Et al. 1984; Cornell R. et al 1990; Greenway Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни H. 1992].

К факторам, содействующим развитию ЭОК, относят долгосрочную инсоляцию, хим канцерогены, также ионизирующее излучение [Tolbert P. et al. 1997; Armstrong B. et al. 2001]. Определенную роль отводят наследным и иммунологическим нарушениям [Молочков В.А. и др Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. 2006, Снарская Е.C. 2004; Grossman D. et al. 1997]. В последние годы в связи с достижениями в области молекулярной биологии сложились предпосылки для исследования новых качеств этиологии и патогенеза ЭОК. А именно, предпринимаются пробы найти Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии отдельных вариантов ЭОК – плоскоклеточного рака, базальноклеточного рака, актинического кератоза, кератоакантомы, себорейного кератоза [Shamanin V. et al. 1996; Harwood A. et al. 2000; Iftner A. et Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни al. 2003].

Число нездоровых, страдающих болезнями, ассоциированными с ВПЧ, продолжает безпрерывно возрастать [Walboomers J. et al. 1999]. В текущее время понятно около 200 генотипов вирусов папиллом, из их к родам, инфицирующих человека, относятся alpha-, beta-, gamma-, mu Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни- и nu. Опасность ВПЧ-инфекции заключается в высочайшей онкогенности отдельных разновидностей вируса [Lorincz A. et al. 1992]. Так, ВПЧ-16 и ВПЧ-18, относящиеся к роду alpha, признаны главным этиологическим агентом рака шеи матки Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни и других раков аногенитальной области [ВОЗ, 1996]. Эпидемиологические и молекулярно-биологических данные позволяют полагать, что ВПЧ рода beta могут обусловливать формирование ряда ЭОК, но данная связь в текущее время совсем не обусловлена Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. Частота выявления ВПЧ в разных ЭОК значительно различается [Shamanin V. et al. 1996; Harwood C. et al. 2000; Iftner A. et al.2003 Forslund O. et al. 2003; de Villier E.-M. et al. 1999]. Это обосновано многообразием применяемых Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни с этой целью лабораторных способов: наименее чувствительные - способны обнаруживать вирус только при его высочайшей концентрации, более чувствительные – даже единичные копии вируса в коже [Meyer T. et al. 2000]. Не считая того Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни, подразумевают, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь в популяции обитателей Восточной Европы, обитателей Центральной Европы и Америки [zur Hausen P. et al., 2005]. В Рф подобные исследования не Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни проводились.

В ближайшее время стало естественным, что обычное обнаружение ВПЧ в ЭОК не может являться прямым подтверждением этиологической роли ВПЧ в развитии данных состояний. Обнаружение ВПЧ в патологически модифицированном эпителии кожи Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни может быть следствием, как активной вирусной инфекции, так и независящей бессимптомной персистенции, соответствующей для условно-патогенных заразных агентов. Потому, кроме выявления ВПЧ, нужно проводить измерение вирусной нагрузки [Snijders P. 2003]. Определение вирусной нагрузки Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни является сравнимо новым подходом в диагностике ВПЧ-инфекции, показавшим свою высшую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной папилломавирусной инфекции [Snijders P. 2003]. Таким макаром, в текущее время не вызывает колебаний необходимость проведения Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни количественного анализа вирусных геномов в ЭОК, что позволит более беспристрастно судить о нраве присутствия ВПЧ в опухолях кожи, а как следует, поглубже осознавать механизмы, связывающие ЭОК с ВПЧ [Harwood C. 2004; zur Hausen Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни P. 2005; Weissenborn S. 2005; Peter J. 2006].

Более увлекательной моделью для исследования связи вирусной нагрузки ДНК ВПЧ с медицинской динамикой течения опухолевого процесса представляет кератоакантома. Понятно, что эта опухоль стремительно проходит стадию роста и стабилизации, а потом Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни спонтанно самоизлечивается с формированием выраженного иммунного ответа на антигены опухоли [Беренбейн и др. 1980; Молочков В.А. и др. 2006, Schwartz et al.] Но в «атипичных» случаях кератоакантома персистирует и даже подвергается злокачественному перерождению Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. Нареченные особенности течения кератоакантомы завлекают внимание к ней многих исследователей как к комфортной модели исследования вирус-индуцированного канцерогенеза в коже [Молочков В.А. и др. 2006; Shwartz R. et al. 1994, Zelickson A Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. et al. 1961; Forslund O. et al. 2003].

С учетом вышеизложенного, проведение исследовательских работ, изучающих ассоциацию ВПЧ с разными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на базе количественного определения ДНК ВПЧ, является животрепещущей задачей Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни дерматоонкологии, решение которой будет содействовать предстоящему осознанию взаимосвязей ЭОК с ВПЧ.

^ Цель исследования: изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с вирусом папилломы человека на базе количественного анализа ДНК ВПЧ.

Задачки исследования:

  1. Создать методику количественного Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни выявления ДНК ВПЧ в коже.

  2. Изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с ВПЧ.

  3. Найти вирусную нагрузку ДНК ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

  4. На примере кератоакантом изучить изменение вирусной нагрузки ДНК ВПЧ зависимо от Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни динамики клинического течения опухолевого процесса.

^ Научная новизна.

В первый раз разработана количественная методика обнаружения кожных типов ВПЧ рода beta с внедрением ПЦР в режиме реального времени.

При помощи количественного Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни анализа в первый раз детально исследована ассоциация доброкачественных (себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК с ВПЧ рода beta.

На примере кератоакантом продемонстрировано ранее не описанное изменение Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни вирусной нагрузки ДНК ВПЧ зависимо от динамики клинического течения опухолевого процесса.

^ Положения, выносимые на защиту:

  1. Доброкачественные (себорейный кератоз, кератоакантома) предраковые (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественные (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК более Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни чем в 70% случаев ассоциированы с заразой ВПЧ рода beta.

  2. Концентрация ДНК ВПЧ у нездоровых ВПЧ-ассоциированными ЭОК достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ (контрольная группа).

  3. Динамика вирусной нагрузки Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни ВПЧ может обрисовывать клиническое течение ЭОК, что продемонстрировано на примере кератоакантом.

^ Внедрение в практику.

Результаты работы употребляются в целебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических заболеваний ФППОВ ММА им. И Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни.М. Сеченова, кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, также на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.


^ Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и оговорены на заседании Столичного областного общества Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни дерматовенерологов (Москва 2005, 2007); на научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи», Москва 25-26 апреля 2006 года; научно-практической конференции «Современная диагностика и исцеление урогенитального хламидиоза», Москва 26-27 апреля 2007 года; 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни 2006 Prague, September 1-7 2006 (постерный доклад); на научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии», М., 2006.

Публикации.

По теме диссертации размещено 10 печатных работ.

^ Структура диссертации.

Диссертация изложена на 117 страничках машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни, описания материалов и способов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 29 российских и 179 забугорных работ. Работа иллюстрирована 3 фото, 10 рисунками и 16 таблицами.


^ Содержание работы.

Материалы и способы.

Группа лиц, вошедших Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни в исследование, была сформирована в согласовании с данными мировой научной литературы, согласно которым ВПЧ рода beta ассоциирован c отдельными вариациями доброкачественных (бородавка, себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни (плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак) ЭОК [].

В истинное исследование включены 135 нездоровых с доброкачественными, предраковыми и злокачественными новообразованиями кожи, в том числе 10 нездоровых себорейным кератозом (СК), 21 нездоровой кератоакантомой (КА), 15 нездоровых актиническим кератозом (АК) и 5 нездоровых Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни заболеванием Боуэна (ББ), 74 нездоровых базальноклеточным раком (БКР) кожи, 10 нездоровых плоскоклеточным раком (ПКР) кожи (табл.1). 87 нездоровых имели единичные (солитарные) очаги поражения, 46 - множественные. Посреди их было 68 парней и 65 дамы в возрасте от 33 до Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни 79 лет. Во всех группах нездоровых преобладали лица приклонного возраста: средний возраст при БКР составил – 65,2 ± 10,4 года, при ПКР – 69,4 ± 6,9 лет, при АК 66,5 ± 12,5 лет, при КА 67 ± 10,2, при СК 63,6 ± 11,7 лет, при ББ – 60 ± 10,7 лет. Контрольная группа была представлена 49 добровольцами – 21 мужик Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни и 28 дам в возрасте от 29 до 78 лет (средний возраст 58 ± 14,5 года), у каких кожные заболевания, в том числе, ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали.

^ Таблица 1.

Рассредотачивание нездоровых по нозологиям.

Группа новообразований

Нозологическая форма

Количество Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни нездоровых

Количество исследованных опухолевых очагов

^ Доброкачественные опухоли кожи

Себорейный кератоз

10

16

Кератоакантома

21

21

^ Предраковые состояния

Актинический кератоз

15

15

Болезнь Боуэна

3

3

^ Злокачественные опухоли кожи

Базальноклеточный рак

74

82

Плоскоклеточный рак

10

10

Всего:




133

147


Кроме принятых способов исследования – физических, инструментальных, лабораторных, всем нездоровым проводили цитологическое и/либо гистологическое Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни исследование.


^ Генодиагностика ВПЧ-инфекции. Материалом для молекулярно-биологического исследования служили микробиоптаты кожи размером 0,2 х 0,2 см, приобретенные при помощи малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным методом, либо суспензия клеток, приобретенная способом соскоба, который употреблялся только для Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни взятия материала из зон новообразований, где имелись нарушения сцепления меж клеточками, и скарификация обеспечивала получение достаточного количества клеточной массы.

Исследуемый материал помещали в отдельные пробирки, содержащие 1 мл транспортной среды (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни, Москва). Для наибольшего сохранения количества клеточной и вирусной ДНК пробирки замораживали сходу после взятия материала и хранили до проведения ПЦР-анализа при -70 С.

Пробоподготовка исследуемого материала осуществлялась способом обработки ткани протеиназой К Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни с следующим выделением ДНК способом аффинной сорбции на силикагеле с внедрением набора для выделения «ДНК-сорб-С» согласно аннотации производителя (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Элюция проводилась в 100мкл ТЕ-буфера. Эталоны Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни, содержащие очищенную ДНК, использовались в реакции амплификации нуклеиновых кислот.

Для разработки методики количественного определения ВПЧ рода beta, а так же оценки ее чувствительности и специфики, использовались рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta - 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65 (M. Favre Institut Pasteur,Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Humain, France; E.-M. de Villiers, Abteilung tumorvirus-Charakterisierung Referenzzenturum fur Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни Humanpathogene Papillomviren, Germany), также контрольные плазмиды куска β-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Для выявления ДНК ВПЧ рода beta использовались четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов):

1-я - для выявления генотипов вида β1 (5, 8, 12, 14, 21, 19, 25, 47, 36);

2-я - для Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни выявления генотипов вида β2 (9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80);

3-я - для выявления генотипов вида β3 (49, 75, 76);

4-я - для выявления генотипов вида β4 (92), β5 (96), β1 (20,24 и 93 типы).

Последовательности всех олигонуклеотидов для 25 типов ВПЧ beta рода были выбраны при анализе узнаваемых последовательностей ВПЧ Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни, взятых из Веб ресурса “NCBI GeneBank” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и обработаны с помощью программки AlignX пакета Vector NTI 6 (InforMax Inc., 2000). Во все четыре системы введены олигонуклеотиды к последовательности Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни β-глобинового гена человека, что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля).

Выявление ДНК ВПЧ в приготовленных образчиках проводилось в мультиплексном формате, в 4 пробирках. Любая пробирка содержала одну Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни из групп олигонуклеотидов для выявления ВПЧ, также олигонуклеотиды для выявления β-глобинового гена человека.

В состав обскурантистских консистенций для ПЦР входили последующие составляющие: олигонуклеотидные праймеры и зонды; нуклеотиды в концентрации 0,2 мМ каждого; ПЦР-буфер Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни (66мМ Tris-HCl, PH 8,8, 17 мМ(NH4)2SO4, 4 мM MgCl2, 0,01% Tween 20); TaqF-ДНК-полимераза (2U в реакцию) (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва); очищенная ДНК, выделенная из клинического материала - 10 мкл.

В отдельные пробирки (заместо эталона ДНК Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни) вносили положительные и отрицательные контрольные эталоны (10 мкл). Отрицательный контроль амплификации - представлял обыденную обскурантистскую смесь, в которую заместо эталона ДНК добавлялся ТЕ-буфер. Положительный контроль амплификации - представлял собой кусок специфичной ДНК (контрольные Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни плазмиды ВПЧ в концентрации 104 копий ДНК ВПЧ/мл).

Термоциклирование проводили на амплификаторе Mx3000P (Stratagene,США), соединенным с компьютером по последующей программке: подготовительный шаг 95 0С – 15 мин., потом при 950С – 15 с, при 60 0С – 30с Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни, при 65 0С – 1 мин. – 50 циклов.

Детекция товаров амплификации осуществлялась методом измерения флуоресцентного сигнала, нарастающего по мере скопления специфичного продукта реакции. Получаемая зависимость интенсивности флуоресценции от цикла реакции - кривая флуоресценции - имела в случае положительной Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни реакции соответствующий S-образный вид. В согласовании с этим проводилась высококачественная оценка результатов реакции.

Для количественного анализа использовались десятикратные разведения (6 log – 1 log) положительных плазмидных контролей 5, 8, 15, 37, 38, 20, 24, 49 типов ВПЧ и ДНК человека (эталоны).

Для построения Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни и математической обработки обрисованных кривых использовалась программка построения, обработки, анализа кривых флуоресценции и ведения документации для способа «ПЦР в реальном времени» - Mx3000P (Stratagene, США).


^ Статистическая обработка данных. Достоверность различия частот определяли Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни с помощью аспекта «хи-квадрат». Доверительные границы к частотам рассчитывали на основании биномиального рассредотачивания. Для анализа соответствующих вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов, анализ его связи с другими переменными проводили с Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни внедрением способа параметрической статистики: достоверность различий средних по группам вычисляли при помощи дисперсионного анализа, а доверительные границы к среднему – на базе рассредотачивания Стьюдента.


^ Результаты и обсуждение.

Разработка методики выявления и определения вирусной Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни нагрузки кожных типов ВПЧ рода beta.

Аналитическая специфика методики оценивалась на высококонцентрированных (108 копий ДНК/мл) образчиках контрольной ДНК ВПЧ кожных типов (род alpha, gamma, mu, nu и beta) : 1, 3, 4, 7, 50, 65, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49; ДНК ВПЧ слизистых типов Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни (род alpha): 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82; ДНК, полученную из культур микробов, потенциально колонизирующих кожные покровы и слизистые оболочки S.aureus, S. pyogenus, Ps. aeroginosa, E. coli, U. urealiticum, C.trachomatis, G.vaginalis, T.vaginalis Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни; ДНК человека (куска β-глобинового гена человека). В итоге проведенных исследовательских работ перекрестных реакций не найдено. Положительный сигнал был получен в присутствии ДНК ВПЧ кожных типов рода beta.

^ Аналитическая чувствительность оценивалась с внедрением Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни 10-кратных разведений контрольной панели ДНК ВПЧ 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49 типов. После определения последнего проходящего разведения осуществлялась серия 2-кратных разведений из этой точки. Дальше определялось последнее стопроцентное проходящее разведение (6 точек из 6), которое расценивали как порог Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни аналитической чувствительности.

Аналитическая чувствительность разработанной методики позволяла выявлять генотипы вида β1 (смесь А) - 1250 копий ДНК ВПЧ/мл; генотипы вида β2 (смесь В) – 1000 копий ДНК ВПЧ/мл; генотипы вида β3 (смесь С) – 450 копий ДНК ВПЧ/мл Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни; генотипы вида β4,5,1 (смесь D) – 300 копий ДНК ВПЧ/мл.

Для разработанных систем олигонуклеотидов выявления ДНК ВПЧ beta-папилломавирусов было проведено исследование наличия линейной зависимости меж логарифмом концентрации начальной ДНК-матрицы в образчике и циклом начала роста Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни флуоресценции (пороговым циклом). Такая зависимость лежит в базе проведения количественных измерений в ПЦР в реальном времени (рис. 2).

Набросок 1.

Корреляция логарифма концентрации ДНК ВПЧ и порогового цикла в разработанных системах олигонуклеотидов Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни.

Смесь А Смесь В


Ct

Ct

lgC

lgC


Смесь С Смесь D


Ct

Ct

lgC

lgC



Из рисунков видно, что данные зависимости имели линейный нрав в спектре: для консистенции А- от 2,5 х 103 (3,4lg) до 109 (9lg) копий/мл, для консистенции В – от Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни 5 х 102 (2,7 lg) до 2х107 (7,3 lg) копий/мл , для консистенции С – от 7 х 102 (2,8 lg) до 107 (7 lg) копий/мл , для консистенции D – от 5 х 102 (2,7 lg) до 2х107 (7,3 lg) копий/мл. Коэффициент корреляции (R2) во всех Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни случаях составил >0,99.


^ Оценка свойства образцов по наличию геномной ДНК человека.

Качество клинических образцов (качество забора, транспортировки, хранения, выделения) определялось по количеству геномной ДНК (β-глобинового гена человека). Для заслуги чувствительности более чем 100 копий ДНК Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни ВПЧ/105 клеток человека нами было введено ограничение на малое количество клеток человека в образчике, которое составило 5,9 log (8,0*105) копий ДНК человека/мл. В соответствие с приобретенными данными, все эталоны, содержащие Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни наименее чем 5,9 log ДНК человека/мл, числились невалидными.

^ Расчет нормализованной вирусной нагрузки.

Способ ПЦР в режиме реального времени, положенный нами в базу разработки методики количественного выявления ВПЧ рода beta, позволял определять абсолютное Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни количество ДНК ВПЧ и геномов человека в пробе. С учетом того, что при одном и том же способе взятия клинического материала из очагов ЭОК либо обычного эпителия кожи количество клеток (а соответственно и копий вируса Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни), попадающих в эталон, значительно варьировало, нами была предложена методика нормирования количества вируса на количество клеток человека, что является оправданным в отношении внутриклеточных заразных агентов. Схожий стандартизованный подход позволял получать надежные Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни и достоверные данные о вирусной нагрузке при разных патологиях кожи.

Расчет нормализованной вирусной нагрузки выполнялся по формуле:


ВН = Log ((Кол-во ДНК ВПЧ / Кол-во ДНК чел.)* 105).


^ Выявление и определение вирусной Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни нагрузки кожных типов ВПЧ рода beta (25 генотипов) у нездоровых эпителиальными опухолями кожи.

Выявление и определение вирусной нагрузки кожных типов ВПЧ рода beta (25 генотипов) у нездоровых ЭОК проводилось в два шага. Сначало все эталоны Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни кожи нездоровых ЭОК и контрольной группы были протестированы на присутствие ДНК ВПЧ рода beta (табл.2).


^ Таблица 2.

Выявляемость ДНК ВПЧ рода beta в эпителиальных опухолях и образчиках обычной кожи.

Исследуемые эталоны


Кол-во образцов

Количество Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни ВПЧ - образцов

Количество

ВПЧ +

образцов

Abs.

%

Abs.

%

Себорейный кератоз

16

4

25,0

12

75,0

Кератоакантома

21

5

23,8

16

76,2

Актинический кератоз

15

1

6,7

14

93,3

Болезнь Боуэна

5

1

20,0

4

80,0

Базальноклеточный рак

82

15

18,3

67

81,7

Плоскоклеточный рак

10

3

30,0

7

70,0

Обычная кожа

49

26

53,1

23

46,9

Всего

196

47

27,0

126

73,0


Как видно из табл. 2, злокачественные (ПКР, БКР), также предраковые (АК, ББ) и доброкачественные (СК, КА) опухоли кожи в достаточно Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни высочайшем проценте случаев были ассоциированы с ВПЧ: последовательности ДНК ВПЧ рода beta выявлялись в 75% случаев СК, 76,2% - КА, 93,3% - АК, 80,0% - ББ, 81,7% - БКР, 70% - ПКР. Вместе с этим, ВПЧ beta рода обнаруживался в микробиоптатах Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни обычной кожи здоровых доноров в 46,9%.

Понятно, что возможный риск персистенции и прогрессии ВПЧ-инфекции находится в зависимости от типа либо вида ВПЧ (т.к. филогенетическое родство разных генотипов ВПЧ в границах 1-го вида Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни определяет их схожие био характеристики), также от совместной инфицированности клеток эпителия генотипами 1-го либо нескольких видов ВПЧ [Munoz N. Et al., 2004]. С учетом этого мы проанализировали данные о частоте обнаружения разных видов Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни ВПЧ рода beta, также данные о частоте их ассоциаций в образчиках ЭОК и обычной коже.

Было установлено, что как в ЭОК, так и обычной коже выявлялся очень широкий диапазон генотипов Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни ВПЧ рода beta, принадлежащих к разным видам (β1, β2, β3, β4, β5). В образчиках доброкачественных (СК и КА) ЭОК, также в обычной коже представители разных видов ВПЧ - β1, β2, β3, β4, β5 - встречались примерно с схожей частотой. В образчиках предраковых и злокачественных (БКР Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни и ПКР) ЭОК папилломавирусы β1 и β2 видов встречались в 1,5-2 раза почаще, чем представители β3, β4-β5 видов (табл. 3).

Таблица 3.

Сравнительная частота обнаружения разных видов ВПЧ рода beta в эпителиальных опухолях и обычной коже.

Исследуемые эталоны

Кол-во ВПЧ Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни+ образцов

Виды ВПЧ

beta-1*

(%)

beta-2*

(%)

beta -3*

(%)

beta- 4,5*

(%)

Себорейный кератоз (n=16)

12

6 (50,0)

7 (58,3)

5 (41,6)

6 (50,0)

Кератоакантома

(n=21)

16

10 (62,5)

11 (68,7)

8 (50,0)

9 (56,2)

Актинический кератоз (n=15)

14

12 (85,7)

14 (100)

7 (50,0)

5 (35,7)

Базальноклеточный рак (n=82)

67

50 (74,6)

51 (76,1)

24 (35,8)

11 (16,4)

Плоскоклеточный рак (n=10)

7

6 (85,7)

5 (71,4)

2 (28,5)

1 (14,2)

Обычная кожа (n=49)

23

8 (34,0)

11 (47,0)

6 (26,0)

11 (47,0)

*в том числе в ассоциации с другими видами


В 66,6% - 100% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни поболее видов ВПЧ рода beta. Оборотная ситуация констатирована при исследовании ВПЧ положительных образцов здоровой кожи лиц контрольной группы: больший процент наблюдений (78,3%) составили случаи инфицирования только одним видом ВПЧ рода Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни beta (р<0,01) (табл.4).


Таблица 4.

Встречаемость 1-го либо нескольких видов ВПЧ рода beta в образчиках эпителиальных опухолей и обычной коже.


Исследуемые эталоны

Кол-во ВПЧ+

образцов

Один вид ВПЧ в образчике

2 и > видов ВПЧ в образчике

Abs.

%

Abs Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни.

%

Себорейный кератоз

12

4

33,3

8

66,6

Кератоакантома

16

4

25,0

12

75,0

Болезнь Боуэна

4

-

-

4

100

Актинический кератоз

14

-

-

14

100

Базальноклеточный рак

67

21

31,4

46

68,6

Плоскоклеточный рак

7

-

-

7

100

Обычная кожа

23

17

78,3

5

21,7


Таким макаром, приобретенные нами при использовании разработанной методики результаты не противоречат данным забугорных исследователей, использовавшим для обнаружения ВПЧ в коже высокочувствительные и высокоспецифичные неколичественные способы ПЦР Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни-анализа [Berchout J. 1995; de Villiers E. 1999; Boxman I. 2000; Forslund O. 2003]. Это позволяет использовать наш способ выявления ВПЧ рода beta в предстоящем для исследования ВПЧ – ассоциированных болезней кожи.

Вкупе с тем, обширное распространение ВПЧ как Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни в ЭОК, так и обычном эпителии кожи, продемонстрированное в работах забугорных создателей [Astori G. 1998;; Boxman I. et al. 1999, 2000; Atonsoon А. et al. 2000] и подтвержденное нами, не позволяет категорически утверждать конкретное роль ВПЧ Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни в формировании опухолевых болезней кожи. В связи с этим, на последующем шаге исследования был проведен количественный анализ, включающий определение вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в ВПЧ-положительных образчиках ЭОК и обычной кожи и Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни нормирование количества ДНК ВПЧ на количество клеток человека.

В итоге проведенного количественного анализа было установлено, что средние характеристики вирусной нагрузки ДНК ВПЧ во всех ВПЧ положительных ЭОК превосходили средние характеристики Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в обычной коже (1,4 ± 0,6 логарифма на 100 тыс. клеток), при этом при СК (3,0 ± 0,7 логарифма на 100тыс. клеток), КА (3,2 ± 1,6 логарифма на 100 тыс. клеток), АК (4,5± 1,2 логарифма на 100 тыс. клеток) и БКР (2,08 ± 1,4 логарифма на 100 тыс Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. клеток) различия имели достоверный нрав (рис. 2).

Набросок 2.

Средний логарифм вирусной нагрузки в эпителиальных опухолях и обычной коже.


* - p < 0,05

** - p < 0,0001


log ДНК ВПЧ/105 клеток




Количественный анализ, примененный нами, показал, что при больших показателях Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни ассоциации ВПЧ с ЭОК и обычной кожей, вирусная нагрузка в большинстве ЭОК достоверно превосходит этот показатель в обычной коже. Повышение вирусной нагрузки в образчиках ЭОК, по сопоставлению с обычной кожей, показывает на активацию ВПЧ Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни и может свидетельствовать, на наш взор, о роли ВПЧ или как об этиологическом факторе, или как о факторе, влияющем на течение и/либо прогноз заболевания.

Таким макаром, количественное измерение вирусных частиц Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни позволяет более точно судить о нраве присутствия вируса в опухолевой ткани и может рассматриваться как желательный способ для исследования связи вируса с развитием, течением либо прогрессированием заболевания.

Специально была проанализирована зависимость Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в образчиках КА с учетом цикличности ее течения. Было установлено, что в фазу роста КА, т.е. в период более насыщенного деления клеток, средняя вирусная нагрузка ДНК ВПЧ составила Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни 3,1 ± 1,6 логарифмов на 100 тыс. клеток. В фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 логарифмов на 100 тыс. клеток. В фазу регресса средняя вирусная нагрузка ДНК ВПЧ уменьшилась до 1,6 ± 1,5 логарифмов на 100 тыс. клеток (табл.5).


^ Таблица 5.

Средний логарифм вирусной Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни нагрузки зависимо от фазы

развития кератоакантом.

Фаза развития кератоакантом

Всего

Кол-во образцов

ВПЧ +

Средний логарифм вирусной нагрузки

(log ДНК ВПЧ/105 клеток)

Рост

6

6

(28,6%)

3,1 ± 1,6

Стабилизация

8

8

(38,1%)

3,9 ± 1,6

Регресс

7

2

(9,5%)

1,6 ± 1,5

Всего

21

16 (76,2%)





Таким макаром, вирусная нагрузка, измеряемая в разных фазах эволюции КА, росла по мере дифференцировки опухоли Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. В стадии регресса КА концентрация ДНК ВПЧ уменьшалась более чем в 20 раз, при этом у 5 (23,8%) пациентов не определялась, что может свидетельствовать о понижении концентрации ДНК ВПЧ ниже детектируемого уровня либо о полной элиминации вируса Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. Как следует, динамика концентрации ДНК ВПЧ может отражать этапы клинического течения КА, что, в свою очередь косвенно подтверждает прямое роль ВПЧ в развитии ЭОК.


ВЫВОДЫ

  1. Выявление и определение вирусной нагрузки ДНК 25 генотипов Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни ВПЧ рода beta в коже может проводиться при помощи разработанной количественной методики на базе ПЦР в режиме реального времени.

  2. При помощи ПЦР в режиме реального времени ассоциация ЭОК с ДНК ВПЧ Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни рода beta была выявлена в 75 % случаев себорейного кератоза, 76,2 % - кератоакантом, 93,3 % - актинического кератоза, 80,0 % - заболевания Боуэна, 81,7 % - базальноклеточного рака кожи и 70,0% - плоскоклеточного рака кожи. В обычной коже здоровых людей ДНК ВПЧ рода beta обнаруживался в 46,9 % случаев Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни.

  3. В образчиках предраковых (актинический кератоз) и злокачественных (базальноклеточный и плоскоклеточный рак кожи) ЭОК папилломавирусы β1 и β2 видов встречались в 1,5-2 раза почаще, чем представители β3, β4-β5 видов. В 66,6% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и поболее видов ВПЧ рода Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни beta.

  4. В процессе количественного анализа было установлено, что вирусная нагрузка ДНК ВПЧ во всех ЭОК превосходила вирусную нагрузку ДНК ВПЧ в обычной коже (1,4 ± 0,6 lg/ 105 клеток), при этом при себорейном кератозе (3,0 ± 0,7 lg/ 105 клеток), кератоакантоме (3,2 ± 1,6 lg Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни/ 105 клеток), актиническом кератозе (4,5± 1,2 lg/ 105 клеток) и базальноклеточном раке кожи (2,08 ± 1,4 lg/ 105 клеток) различия имели достоверный нрав.

  5. На примере кератоакантом продемонстрирована ранее не показанная связь вирусной нагрузки ДНК ВПЧ с динамикой Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни клинического течения опухолевого процесса: в фазу роста кератоакантом вирусная нагрузка составила 3,1 ± 1,6 log/105 клеток, в фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 log/105 клеток, в фазу регресса - 1,6 ± 1,5 log/105 клеток.



^ Перечень работ, размещенных по теме диссертации.

  1. Кладова А.Ю., Хлебникова А Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни.Н Козлова Е.С. К дилемме патогенеза и исцеления базалиомы кожи// V научно-практическая конференция «Социально важные заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». – М., 2005.- С.58-59;

  2. Куевда Д.А., Кладова А.Ю Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни., Шипулина О.Ю., Молочков В.А. Разработка методики количественного определения папилломавирусов рода Бета// VI научно-практическая конференция «Социально важные заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика».– М.- 2006.- С. 97-98;

  3. Кладова А.Ю., Куевда Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни Д.А., Молочков В.А., Шипулина О.Ю., Козлова Е.С., Прокофьев А.А. Количественное определение вируса папилломы человека (ВПЧ) в эпителиальных образованиях и других пролиферативных заболеваниях кожи// VI научно-практическая конференция «Социально важные Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». – М.- 2006.- С. 74-75;

  4. Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Молочков В.А., Шипулина О.Ю., Киселев В.И., Хлебникова А.Н., Козлова Е.С. Встречаемость кожных типов Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни вируса папиллом человека в патологиях кожи // Альманах медицинской медицины. – 2006. - Том IX. – С. 44-50;

  5. Молочков В.А., Кладова А.Ю. Базалиома на фоне невуса сальных желез// Русский журнальчик кожных и венерических заболеваний. – 2006. - № 3. – С Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. 10-12;

  6. Kladova A., Kuevda D., Molochkov V., Pokrovskii V., Shipulina O., Kozlova E. Human papillomavirus –DNA loads in skin pathologies and normal skin // Abstract in 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни. – Prague, 2006. – P. 185;

  7. Kuevda D., Kladova A., Shipulina O., Molochkov V., Pokrovskii V. Novel Real-time PCR based quantitative assay for detection of broad spectrum of Beta - human papillomaviruses// Abstract in 23-d international papillomavirus conference and Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни clinical workshop. – Prague, 2006. – P. 285;

  8. Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Молочков В.А., Кунцевич Ж.С., Прокофьев А.А. К ассоциации кератоакантом с вирусом папилломы человека// Альманах медицинской медицины. – 2007. - Том Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни IX. – C. 40-44;

  9. Хлебникова А.Н., Кладова А.Ю., Кириченко Н.А., Сарханн В.С. К дилемме циклопических базалиом// Клиническая дерматология и венерология. – 2007. - № 1. – С.9-12;

  10. Козлова Е.С. Быков А.С., Кладова А.Ю., Куевда Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека. 14. 00. 11. кожные и венерические болезни Д.А. Исследование неких вирусо-бактериальных ассоциаций при псориазе// Альманах медицинской медицины. – 2007. – Том XV. – C. 191-194.


artikulyacionnij-apparat-obrazovanie-zvuka.html
artikulyacionnij-otdel-zvukoproiznosyashij.html
artillerijskaya-razvedka.html